近日，日本京都大學(xué)博士畢業(yè)生、目前在美國(guó)芝加哥大學(xué)從事博士后研究的錢(qián)年超和合作者開(kāi)發(fā)出一種全新的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)——立體DNA顯微鏡。

圖|錢(qián)年超（來(lái)源：錢(qián)年超）

研究中，他們成功重構(gòu)了24hpf斑馬魚(yú)胚胎的三維形態(tài)，并以三維方式重現(xiàn)了Stereo-seq捕獲的空間基因表達(dá)模式，證明該技術(shù)在構(gòu)建組織樣品三維空間轉(zhuǎn)錄組上的可行性。

另外，他們還開(kāi)發(fā)了一種名為測(cè)地譜嵌入（GSE，GeodesicSpectralEmbeddings）的數(shù)據(jù)降維方法，其能處理測(cè)序數(shù)據(jù)以及重構(gòu)斑馬魚(yú)胚胎的圖像，為非線性大數(shù)據(jù)的降維提供了一種新工具。

之所以能夠?qū)崿F(xiàn)以上成果，是因?yàn)樗麄冊(cè)跓o(wú)需依賴微流控系統(tǒng)、光學(xué)顯微鏡等特殊設(shè)備和先驗(yàn)知識(shí)的前提下，使用滾環(huán)擴(kuò)增這一等溫?cái)U(kuò)增方法產(chǎn)生的DNA納米球可以將RNA的遺傳信息進(jìn)行空間編碼，進(jìn)而能夠使用DNA分子標(biāo)記DNA納米球的鄰近關(guān)系，而后可以針對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。

論文發(fā)表之后，錢(qián)年超等人受到NatureBiotechnology期刊編輯邀請(qǐng)發(fā)表了一份研究簡(jiǎn)報(bào)，該簡(jiǎn)報(bào)由錢(qián)年超等論文作者、期刊編輯和行業(yè)專家共同完成的，是對(duì)本次成果的概括和評(píng)價(jià)。在簡(jiǎn)報(bào)中，專注于單細(xì)胞空間蛋白質(zhì)組學(xué)的生物技術(shù)公司的瑞典公司PixelgenTechnologies的CEO西蒙?弗雷德里克松（SimonFredriksson）教授評(píng)價(jià)稱：“這項(xiàng)工作為三維、無(wú)偏見(jiàn)地分析生物學(xué)提供了一條途徑，這將是一項(xiàng)偉大的成就。在沒(méi)有光和熒光團(tuán)的情況下定位生物分子具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出傳統(tǒng)顯微鏡的潛在可擴(kuò)展性?！?/p>

目前，本次立體DNA顯微鏡可以獲得24hpf斑馬魚(yú)胚胎的三維空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)，但是仍然還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率。未來(lái)，他們將會(huì)持續(xù)優(yōu)化這一技術(shù)。

（來(lái)源：NatureBiotechnology）

若干年后，如能實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率，可能產(chǎn)生潛在的應(yīng)用有：

首先，目前立體DNA顯微鏡僅能獲得三維空間轉(zhuǎn)錄組信息，但是由于該技術(shù)有很好的可擴(kuò)展性，因此未來(lái)有望實(shí)現(xiàn)空間基因組、空間蛋白組、空間ATAC-seq等三維空間多組學(xué)以及三維時(shí)空組信息的檢測(cè)；其次，本次成果可以提高檢測(cè)腫瘤微環(huán)境的維度，確定完整組織中與癌細(xì)胞相互作用的免疫細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞；再次，可以解析胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)而發(fā)掘決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵微環(huán)境組分；最后，可以與電子顯微鏡互補(bǔ)，繪制大腦的連接組。

（來(lái)源：NatureBiotechnology）

開(kāi)發(fā)立體DNA顯微鏡，解決現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的局限性

在開(kāi)展本次研究之前，錢(qián)年超主要研究發(fā)育和病毒感染過(guò)程中膜蛋白的功能和分子機(jī)制。在研究膜蛋白的分子機(jī)制過(guò)程中，錢(qián)年超發(fā)現(xiàn)他所研究的三種膜蛋白TRIC-B、TRPM7和TMEM120A均非獨(dú)立發(fā)揮作用，而是都要與周圍的其他蛋白質(zhì)或者小分子相互作用才能完成一定的功能。這讓他意識(shí)到在微米甚至納米層面上，膜蛋白周圍環(huán)境中的生物分子對(duì)其正常功能的重要性。

但是，當(dāng)時(shí)研究單個(gè)膜蛋白的分子機(jī)制至少需要2年，主要原因是當(dāng)時(shí)所用的技術(shù)手段太局限。比如，傳統(tǒng)的免疫熒光染色和熒光原位雜交等技術(shù)，雖然可以定位已知蛋白質(zhì)、RNA、DNA等生物大分子，并能根據(jù)已有文獻(xiàn)和研究者經(jīng)驗(yàn)去驗(yàn)證可能與它們相互作用的其他分子，然而往往通量較低即一次可檢測(cè)的分子數(shù)量較少，而且只能檢測(cè)已知目標(biāo)。使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)固然可以高通量地檢測(cè)單細(xì)胞中的RNA分子，但是無(wú)法確定它們之間的相互作用。

顧名思義，相互作用——就是在空間上接近并互相影響，所以如能獲得生物分子的空間信息，就可以在一定程度上推定它們之間的相互作用。2016年，空間轉(zhuǎn)錄組概念被提出之后，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)很快就被NatureMethods評(píng)為“2020年年度技術(shù)”，至今已經(jīng)進(jìn)入快速發(fā)展時(shí)期。而且隨著空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，腫瘤微環(huán)境等方向已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)之所以能夠迅速崛起和得到廣泛應(yīng)用，就是因?yàn)樵摷夹g(shù)既可以高通量地檢測(cè)RNA和細(xì)胞類型，又可以保留它們?cè)诮M織內(nèi)的原位空間信息。它可以為組織樣品繪制一張?jiān)敿?xì)的“地圖”來(lái)展示RNA在其中的空間位置，這樣就能推測(cè)細(xì)胞-細(xì)胞之間、RNA-RNA之間的相互作用。錢(qián)年超表示：“之所以用‘推測(cè)’，沒(méi)有用‘明確’，是因?yàn)槟壳暗目臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)還有很多局限性?！?/p>

這些局限性主要是：

首先，由于沒(méi)有單細(xì)胞分辨率，因此需要使用復(fù)雜的算法來(lái)進(jìn)行細(xì)胞分割；其次，只能檢測(cè)2D組織切片，而且由于需要在2D平面上標(biāo)記RNA的空間信息，導(dǎo)致現(xiàn)有標(biāo)記技術(shù)都需要把組織強(qiáng)行地像素化。雖然可以把連續(xù)2D組織切片的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合成3D形式，但是在切片制備的過(guò)程中RNA難免會(huì)丟失或錯(cuò)位，同時(shí)數(shù)據(jù)整合過(guò)程也極具挑戰(zhàn)性。另外，即使2D組織切片也會(huì)有一定的厚度，也就是說(shuō)它并不是純粹的2D平面，所以不同細(xì)胞的RNA難免會(huì)重疊投射到2D平面上；再次，需要特殊的儀器設(shè)備或試劑，導(dǎo)致應(yīng)用成本較高。

這些局限性共同限制了該技術(shù)的可擴(kuò)展性和進(jìn)一步普及。2019年，美國(guó)芝加哥大學(xué)教授約書(shū)亞·溫斯坦（JoshuaA.Weinstein）教授和團(tuán)隊(duì)（即錢(qián)年超目前的合作導(dǎo)師）發(fā)表了一篇Cell論文并提出“DNA顯微鏡”這一概念。DNA顯微鏡是將RNA的遺傳信息通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR，PolymeraseChainReaction）來(lái)原位擴(kuò)增并用分子識(shí)別碼（UMI，UniqueMolecularIdentifier）標(biāo)記為DNA。

隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，DNA會(huì)以RNA為中心向外擴(kuò)散形成DNApolonies，然后通過(guò)重疊延伸PCR將相鄰的DNApolonies用事件識(shí)別碼（UEI，UniversalEventIdentifiers）來(lái)串聯(lián)標(biāo)記，最后針對(duì)所得的串聯(lián)DNA分子進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而重構(gòu)出RNA的相對(duì)空間位置。

當(dāng)時(shí)，錢(qián)年超正在清華大學(xué)做博士后，看到這篇論文時(shí)給他的第一印象就是很酷。反復(fù)閱讀以后，他意識(shí)到DNA顯微鏡或許能夠克服現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的缺陷。于是，錢(qián)年超申請(qǐng)并加入溫斯坦教授團(tuán)隊(duì)，希望能把DNA顯微鏡應(yīng)用到3D組織樣品中。但是，當(dāng)時(shí)的DNA顯微鏡受到PCR條件的限制，因此只能用于2D培養(yǎng)細(xì)胞中。在和溫斯坦教授討論之后，錢(qián)年超決定使用等溫?cái)U(kuò)增方法來(lái)替代PCR，以便能夠重新設(shè)計(jì)DNA顯微鏡。研究中，他和合作者嘗試了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP，Loop-MediatedIsothermalAmplification）、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA，RollingCircleAmplification）兩種等溫?cái)U(kuò)增方法，最后發(fā)現(xiàn)RCA的效果最好。

基于此，錢(qián)年超等人通過(guò)展開(kāi)本次研究，旨在開(kāi)發(fā)立體DNA顯微鏡來(lái)解決現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的局限性，以便實(shí)現(xiàn)真正意義上的具有單細(xì)胞分辨率的3D空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，并使用該技術(shù)去研究在發(fā)育和病毒感染過(guò)程中，生物大分子和細(xì)胞的空間微環(huán)境以及它們的相互作用。

（來(lái)源：NatureBiotechnology）

通過(guò)DNA納米球來(lái)標(biāo)記RNA的空間信息

由于溫斯坦教授此前發(fā)表的Cell論文僅僅使用DNA顯微鏡檢測(cè)了培養(yǎng)細(xì)胞的甘油醛-3-磷酸脫氫酶和β-肌動(dòng)蛋白的空間分布，并重構(gòu)了培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)。所以，在本次研究的初期，錢(qián)年超直接將DNA顯微鏡用于三維組織樣品。具體來(lái)說(shuō)，他使用多聚胸苷引物（poly（T），polythymidine）替換了上述Cell論文中所使用的基因特定引物來(lái)逆轉(zhuǎn)錄RNA。然后，他進(jìn)行了DNA顯微鏡的后續(xù)操作，借此成功重構(gòu)出細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的分布，并構(gòu)建了它的二維空間轉(zhuǎn)錄組。隨后，他們使用DNA顯微鏡檢測(cè)了24hpf斑馬魚(yú)胚胎的空間轉(zhuǎn)錄組，但是所生成的可用于測(cè)序的DNA產(chǎn)量很低，完全無(wú)法用于重構(gòu)斑馬魚(yú)胚胎的形態(tài)。

經(jīng)過(guò)反復(fù)推敲他們意識(shí)到，PCR過(guò)高的變性溫度以及快速的升溫過(guò)程和降溫過(guò)程，都會(huì)影響PCR反應(yīng)在三維胚胎中的順利進(jìn)行，也會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)物在樣品中的均勻擴(kuò)散。

如前所述，他們一共嘗試了LAMP和RCA這兩種等溫?cái)U(kuò)增方法。由于LAMP生成的產(chǎn)物比較復(fù)雜，所以他們并未得到較純的目標(biāo)DNA產(chǎn)物。令人興奮的是，RCA能夠給出清晰的目標(biāo)產(chǎn)物。于是，他們圍繞RCA重新設(shè)計(jì)了DNA顯微鏡技術(shù)，即設(shè)計(jì)出了立體DNA顯微鏡技術(shù)，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)性優(yōu)化。

最初的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

第一，使用poly（T）原位逆轉(zhuǎn)錄RNA生成cDNA；第二，使用cDNA的3端連接兩種RCA引物；第三，將含有不同UMI的兩類單鏈環(huán)狀DNA退火結(jié)合到RCA引物；第四，使用滾環(huán)擴(kuò)增方法生成DNA納米球，進(jìn)而編碼RNA的空間信息（UMI-cDNA）；第五，由于鄰近DNA納米球之間橋聯(lián)含有UEI的DNA分子，因此將相鄰DNA納米球上的UMI拷貝到含UEI的DNA分子上生成UMI-UEI-UMI，從而記錄DNA納米球的鄰近關(guān)系；第六，測(cè)序UMI-cDNA和UMI-UEI-UMI，并分析測(cè)序數(shù)據(jù)。

以上便是他們的設(shè)計(jì)雛形，基本原理是通過(guò)DNA納米球來(lái)標(biāo)記RNA的空間信息，以及通過(guò)鄰近DNA納米球之間形成橋聯(lián)分子來(lái)標(biāo)記其鄰近關(guān)系。

圍繞上述設(shè)計(jì)雛形，他們開(kāi)始了為期大約一年的優(yōu)化過(guò)程。依托在培養(yǎng)細(xì)胞上的便利性，最初錢(qián)年超使用培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)對(duì)設(shè)計(jì)中的每一個(gè)酶促反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。他和合作者一般做到RCA產(chǎn)生DNA納米球?yàn)橹?，以便確定設(shè)計(jì)前半段的反應(yīng)條件。由于在RCA反應(yīng)中加入了熒光色素標(biāo)記的dUTP，因此所產(chǎn)生的DNA納米球會(huì)帶有熒光。經(jīng)過(guò)RCA反應(yīng)之后，在熒光顯微鏡之下，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就可以判斷反應(yīng)條件的好壞。

完成前半段的反應(yīng)條件優(yōu)化后，錢(qián)年超開(kāi)始進(jìn)行端到端的實(shí)驗(yàn)，由于他已經(jīng)知道UMI-cDNA和UMI-UEI-UMI這些預(yù)期產(chǎn)物的片段大小，因此通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)端到端實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物，就可以基本確定反應(yīng)條件的好壞。然后，通過(guò)進(jìn)一步測(cè)序和分析測(cè)序數(shù)據(jù)，就可以定量產(chǎn)物的多少。

通過(guò)使用培養(yǎng)細(xì)胞將實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化之后，接下來(lái)錢(qián)年超轉(zhuǎn)向了用受精后24小時(shí)（24hpf）斑馬魚(yú)胚胎做基準(zhǔn)測(cè)試。因?yàn)榘唏R魚(yú)胚胎很容易大量獲取，也是研究早期胚胎發(fā)育的有力模型，以及基于培養(yǎng)細(xì)胞與三維斑馬魚(yú)胚胎在細(xì)胞數(shù)量、試劑通透性等方面的差異，錢(qián)年超用斑馬魚(yú)胚胎又進(jìn)行了為期一年左右的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。這時(shí)，他終于可以用測(cè)序數(shù)據(jù)重構(gòu)斑馬魚(yú)胚胎的三維形態(tài)。

（來(lái)源：NatureBiotechnology）

UMI-UEI-UMI的產(chǎn)量決定了形態(tài)重構(gòu)的成功與否。但是，他得到的UMI-cDNA產(chǎn)量依然很低，因?yàn)?4hpf斑馬魚(yú)胚胎有大概25,000以上的細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)400個(gè)不同UMI-cDNA，就需要1,000萬(wàn)個(gè)UMI-cDNA。為了解決這一挑戰(zhàn)，錢(qián)年超又進(jìn)一步優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，主要通過(guò)引入了“DNA納米球降解”和“體外轉(zhuǎn)錄”這兩個(gè)核心策略。其表示，DNA納米球降解可為后續(xù)酶反應(yīng)釋放納米球所占的空間，方便酶促反應(yīng)的組分?jǐn)U散；體外轉(zhuǎn)錄可以增加產(chǎn)物的拷貝數(shù)，減少丟失產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)。

經(jīng)過(guò)精心的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和多輪的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，他最終成功地開(kāi)發(fā)出了立體DNA顯微鏡，目前可以構(gòu)建24hpf斑馬魚(yú)胚胎的三維空間轉(zhuǎn)錄組。

圖|相關(guān)論文（來(lái)源：NatureBiotechnology）

日前，相關(guān)論文以《使用立體DNA顯微鏡對(duì)完整生物進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組成像》（SpatialtranscriptomicimagingofanintactorganismusingvolumetricDNAmicroscopy）為題發(fā)表在NatureBiotechnology[1]，錢(qián)年超是第一作者，約書(shū)亞·溫斯坦（JoshuaA.Weinstein）擔(dān)任通訊作者。

參考資料：

1.Qian,N.,Weinstein,J.A.SpatialtranscriptomicimagingofanintactorganismusingvolumetricDNAmicroscopy.NatBiotechnol(2025).https://doi.org/10.1038/s41587-025-02613-z

運(yùn)營(yíng)/排版：何晨龍