近日，日本京都大學博士畢業(yè)生、目前在美國芝加哥大學從事博士后研究的錢年超和合作者開發(fā)出一種全新的空間轉錄組技術——立體DNA顯微鏡。
圖|錢年超（來源：錢年超）
研究中，他們成功重構了24hpf斑馬魚胚胎的三維形態(tài)，并以三維方式重現(xiàn)了Stereo-seq捕獲的空間基因表達模式，證明該技術在構建組織樣品三維空間轉錄組上的可行性。
另外，他們還開發(fā)了一種名為測地譜嵌入（GSE，GeodesicSpectralEmbeddings）的數(shù)據(jù)降維方法，其能處理測序數(shù)據(jù)以及重構斑馬魚胚胎的圖像，為非線性大數(shù)據(jù)的降維提供了一種新工具。
之所以能夠實現(xiàn)以上成果，是因為他們在無需依賴微流控系統(tǒng)、光學顯微鏡等特殊設備和先驗知識的前提下，使用滾環(huán)擴增這一等溫擴增方法產(chǎn)生的DNA納米球可以將RNA的遺傳信息進行空間編碼，進而能夠使用DNA分子標記DNA納米球的鄰近關系，而后可以針對DNA進行測序和數(shù)據(jù)分析。
論文發(fā)表之后，錢年超等人受到NatureBiotechnology期刊編輯邀請發(fā)表了一份研究簡報，該簡報由錢年超等論文作者、期刊編輯和行業(yè)專家共同完成的，是對本次成果的概括和評價。在簡報中，專注于單細胞空間蛋白質組學的生物技術公司的瑞典公司PixelgenTechnologies的CEO西蒙?弗雷德里克松（SimonFredriksson）教授評價稱：“這項工作為三維、無偏見地分析生物學提供了一條途徑，這將是一項偉大的成就。在沒有光和熒光團的情況下定位生物分子具有遠遠超出傳統(tǒng)顯微鏡的潛在可擴展性。”
目前，本次立體DNA顯微鏡可以獲得24hpf斑馬魚胚胎的三維空間基因表達數(shù)據(jù)，但是仍然還沒有實現(xiàn)單細胞分辨率。未來，他們將會持續(xù)優(yōu)化這一技術。
（來源：NatureBiotechnology）
若干年后，如能實現(xiàn)單細胞分辨率，可能產(chǎn)生潛在的應用有：
首先，目前立體DNA顯微鏡僅能獲得三維空間轉錄組信息，但是由于該技術有很好的可擴展性，因此未來有望實現(xiàn)空間基因組、空間蛋白組、空間ATAC-seq等三維空間多組學以及三維時空組信息的檢測；其次，本次成果可以提高檢測腫瘤微環(huán)境的維度，確定完整組織中與癌細胞相互作用的免疫細胞類型，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤浸潤免疫細胞；再次，可以解析胚胎發(fā)育過程中細胞之間的相互作用，進而發(fā)掘決定細胞命運的關鍵微環(huán)境組分；最后，可以與電子顯微鏡互補，繪制大腦的連接組。
（來源：NatureBiotechnology）
開發(fā)立體DNA顯微鏡，解決現(xiàn)有空間轉錄組技術的局限性
在開展本次研究之前，錢年超主要研究發(fā)育和病毒感染過程中膜蛋白的功能和分子機制。在研究膜蛋白的分子機制過程中，錢年超發(fā)現(xiàn)他所研究的三種膜蛋白TRIC-B、TRPM7和TMEM120A均非獨立發(fā)揮作用，而是都要與周圍的其他蛋白質或者小分子相互作用才能完成一定的功能。這讓他意識到在微米甚至納米層面上，膜蛋白周圍環(huán)境中的生物分子對其正常功能的重要性。
但是，當時研究單個膜蛋白的分子機制至少需要2年，主要原因是當時所用的技術手段太局限。比如，傳統(tǒng)的免疫熒光染色和熒光原位雜交等技術，雖然可以定位已知蛋白質、RNA、DNA等生物大分子，并能根據(jù)已有文獻和研究者經(jīng)驗去驗證可能與它們相互作用的其他分子，然而往往通量較低即一次可檢測的分子數(shù)量較少，而且只能檢測已知目標。使用單細胞轉錄組技術固然可以高通量地檢測單細胞中的RNA分子，但是無法確定它們之間的相互作用。
顧名思義，相互作用——就是在空間上接近并互相影響，所以如能獲得生物分子的空間信息，就可以在一定程度上推定它們之間的相互作用。2016年，空間轉錄組概念被提出之后，空間轉錄組技術很快就被NatureMethods評為“2020年年度技術”，至今已經(jīng)進入快速發(fā)展時期。而且隨著空間轉錄組學的發(fā)展，腫瘤微環(huán)境等方向已經(jīng)成為生命科學領域的研究熱點。
空間轉錄組技術之所以能夠迅速崛起和得到廣泛應用，就是因為該技術既可以高通量地檢測RNA和細胞類型，又可以保留它們在組織內(nèi)的原位空間信息。它可以為組織樣品繪制一張詳細的“地圖”來展示RNA在其中的空間位置，這樣就能推測細胞-細胞之間、RNA-RNA之間的相互作用。錢年超表示：“之所以用‘推測’，沒有用‘明確’，是因為目前的空間轉錄組技術還有很多局限性?！?/p>
這些局限性主要是：
首先，由于沒有單細胞分辨率，因此需要使用復雜的算法來進行細胞分割；其次，只能檢測2D組織切片，而且由于需要在2D平面上標記RNA的空間信息，導致現(xiàn)有標記技術都需要把組織強行地像素化。雖然可以把連續(xù)2D組織切片的空間轉錄組數(shù)據(jù)整合成3D形式，但是在切片制備的過程中RNA難免會丟失或錯位，同時數(shù)據(jù)整合過程也極具挑戰(zhàn)性。另外，即使2D組織切片也會有一定的厚度，也就是說它并不是純粹的2D平面，所以不同細胞的RNA難免會重疊投射到2D平面上；再次，需要特殊的儀器設備或試劑，導致應用成本較高。
這些局限性共同限制了該技術的可擴展性和進一步普及。2019年，美國芝加哥大學教授約書亞·溫斯坦（JoshuaA.Weinstein）教授和團隊（即錢年超目前的合作導師）發(fā)表了一篇Cell論文并提出“DNA顯微鏡”這一概念。DNA顯微鏡是將RNA的遺傳信息通過聚合酶鏈式反應（PCR，PolymeraseChainReaction）來原位擴增并用分子識別碼（UMI，UniqueMolecularIdentifier）標記為DNA。
隨著PCR反應的進行，DNA會以RNA為中心向外擴散形成DNApolonies，然后通過重疊延伸PCR將相鄰的DNApolonies用事件識別碼（UEI，UniversalEventIdentifiers）來串聯(lián)標記，最后針對所得的串聯(lián)DNA分子進行測序和數(shù)據(jù)分析，進而重構出RNA的相對空間位置。
當時，錢年超正在清華大學做博士后，看到這篇論文時給他的第一印象就是很酷。反復閱讀以后，他意識到DNA顯微鏡或許能夠克服現(xiàn)有空間轉錄組技術的缺陷。于是，錢年超申請并加入溫斯坦教授團隊，希望能把DNA顯微鏡應用到3D組織樣品中。但是，當時的DNA顯微鏡受到PCR條件的限制，因此只能用于2D培養(yǎng)細胞中。在和溫斯坦教授討論之后，錢年超決定使用等溫擴增方法來替代PCR，以便能夠重新設計DNA顯微鏡。研究中，他和合作者嘗試了環(huán)介導等溫擴增（LAMP，Loop-MediatedIsothermalAmplification）、滾環(huán)擴增（RCA，RollingCircleAmplification）兩種等溫擴增方法，最后發(fā)現(xiàn)RCA的效果最好。
基于此，錢年超等人通過展開本次研究，旨在開發(fā)立體DNA顯微鏡來解決現(xiàn)有空間轉錄組技術的局限性，以便實現(xiàn)真正意義上的具有單細胞分辨率的3D空間轉錄組技術，并使用該技術去研究在發(fā)育和病毒感染過程中，生物大分子和細胞的空間微環(huán)境以及它們的相互作用。
（來源：NatureBiotechnology）
通過DNA納米球來標記RNA的空間信息
由于溫斯坦教授此前發(fā)表的Cell論文僅僅使用DNA顯微鏡檢測了培養(yǎng)細胞的甘油醛-3-磷酸脫氫酶和β-肌動蛋白的空間分布，并重構了培養(yǎng)細胞的形態(tài)。所以，在本次研究的初期，錢年超直接將DNA顯微鏡用于三維組織樣品。具體來說，他使用多聚胸苷引物（poly（T），polythymidine）替換了上述Cell論文中所使用的基因特定引物來逆轉錄RNA。然后，他進行了DNA顯微鏡的后續(xù)操作，借此成功重構出細胞在培養(yǎng)皿中的分布，并構建了它的二維空間轉錄組。隨后，他們使用DNA顯微鏡檢測了24hpf斑馬魚胚胎的空間轉錄組，但是所生成的可用于測序的DNA產(chǎn)量很低，完全無法用于重構斑馬魚胚胎的形態(tài)。
經(jīng)過反復推敲他們意識到，PCR過高的變性溫度以及快速的升溫過程和降溫過程，都會影響PCR反應在三維胚胎中的順利進行，也會影響反應產(chǎn)物在樣品中的均勻擴散。
如前所述，他們一共嘗試了LAMP和RCA這兩種等溫擴增方法。由于LAMP生成的產(chǎn)物比較復雜，所以他們并未得到較純的目標DNA產(chǎn)物。令人興奮的是，RCA能夠給出清晰的目標產(chǎn)物。于是，他們圍繞RCA重新設計了DNA顯微鏡技術，即設計出了立體DNA顯微鏡技術，并對其進行了系統(tǒng)性優(yōu)化。
最初的實驗設計如下：
第一，使用poly（T）原位逆轉錄RNA生成cDNA；第二，使用cDNA的3端連接兩種RCA引物；第三，將含有不同UMI的兩類單鏈環(huán)狀DNA退火結合到RCA引物；第四，使用滾環(huán)擴增方法生成DNA納米球，進而編碼RNA的空間信息（UMI-cDNA）；第五，由于鄰近DNA納米球之間橋聯(lián)含有UEI的DNA分子，因此將相鄰DNA納米球上的UMI拷貝到含UEI的DNA分子上生成UMI-UEI-UMI，從而記錄DNA納米球的鄰近關系；第六，測序UMI-cDNA和UMI-UEI-UMI，并分析測序數(shù)據(jù)。
以上便是他們的設計雛形，基本原理是通過DNA納米球來標記RNA的空間信息，以及通過鄰近DNA納米球之間形成橋聯(lián)分子來標記其鄰近關系。
圍繞上述設計雛形，他們開始了為期大約一年的優(yōu)化過程。依托在培養(yǎng)細胞上的便利性，最初錢年超使用培養(yǎng)細胞來對設計中的每一個酶促反應進行優(yōu)化。他和合作者一般做到RCA產(chǎn)生DNA納米球為止，以便確定設計前半段的反應條件。由于在RCA反應中加入了熒光色素標記的dUTP，因此所產(chǎn)生的DNA納米球會帶有熒光。經(jīng)過RCA反應之后，在熒光顯微鏡之下，通過檢測熒光信號的強弱就可以判斷反應條件的好壞。
完成前半段的反應條件優(yōu)化后，錢年超開始進行端到端的實驗，由于他已經(jīng)知道UMI-cDNA和UMI-UEI-UMI這些預期產(chǎn)物的片段大小，因此通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測端到端實驗的產(chǎn)物，就可以基本確定反應條件的好壞。然后，通過進一步測序和分析測序數(shù)據(jù)，就可以定量產(chǎn)物的多少。
通過使用培養(yǎng)細胞將實驗條件優(yōu)化之后，接下來錢年超轉向了用受精后24小時（24hpf）斑馬魚胚胎做基準測試。因為斑馬魚胚胎很容易大量獲取，也是研究早期胚胎發(fā)育的有力模型，以及基于培養(yǎng)細胞與三維斑馬魚胚胎在細胞數(shù)量、試劑通透性等方面的差異，錢年超用斑馬魚胚胎又進行了為期一年左右的優(yōu)化實驗。這時，他終于可以用測序數(shù)據(jù)重構斑馬魚胚胎的三維形態(tài)。
（來源：NatureBiotechnology）
UMI-UEI-UMI的產(chǎn)量決定了形態(tài)重構的成功與否。但是，他得到的UMI-cDNA產(chǎn)量依然很低，因為24hpf斑馬魚胚胎有大概25,000以上的細胞，每個細胞檢測400個不同UMI-cDNA，就需要1,000萬個UMI-cDNA。為了解決這一挑戰(zhàn)，錢年超又進一步優(yōu)化了實驗條件，主要通過引入了“DNA納米球降解”和“體外轉錄”這兩個核心策略。其表示，DNA納米球降解可為后續(xù)酶反應釋放納米球所占的空間，方便酶促反應的組分擴散；體外轉錄可以增加產(chǎn)物的拷貝數(shù)，減少丟失產(chǎn)物的風險。
經(jīng)過精心的實驗設計和多輪的實驗條件優(yōu)化，他最終成功地開發(fā)出了立體DNA顯微鏡，目前可以構建24hpf斑馬魚胚胎的三維空間轉錄組。
圖|相關論文（來源：NatureBiotechnology）
日前，相關論文以《使用立體DNA顯微鏡對完整生物進行空間轉錄組成像》（SpatialtranscriptomicimagingofanintactorganismusingvolumetricDNAmicroscopy）為題發(fā)表在NatureBiotechnology[1]，錢年超是第一作者，約書亞·溫斯坦（JoshuaA.Weinstein）擔任通訊作者。
參考資料：
1.Qian,N.,Weinstein,J.A.SpatialtranscriptomicimagingofanintactorganismusingvolumetricDNAmicroscopy.NatBiotechnol(2025).https://doi.org/10.1038/s41587-025-02613-z
運營/排版：何晨龍
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